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Concretamente su estructura es β-D-galactopiranosil-(1→4)-D-glucopiranosa; en el enlace interviene el carbono 1 de la galactosa (en configuración beta) y el carbono 4 de la glucosa (ambos anómeros de la glucosa, α o ß, pueden formar la lactosa). Al formarse el enlace entre los dos monosacáridos se desprende una molécula de agua. Además, este compuesto posee libre el hidroxilo hemiacetálico (en el carbono 1 de la glucosa), por lo que da la reacción de Benedict, es decir es un azúcar reductor.
Cristaliza con una molécula de agua de hidratación, con lo que su fórmula es: C12H22O11·H2O, por ello se la puede también llamar lactosa monohidrato. La masa molar de la lactosa monohidrato es 360,32 g/mol. La masa molar de la lactosa anhidra es 342,30 g/mol.