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La primera fundación de la ciudad de Santiago se efectuó el 15 de Agosto de 1534, en la actual Riobamba, de carácter provisional por Diego de Almagro. Tiempo después parten dos expediciones: una hacia el norte, cuya fundación sería de la villa de San Francisco de Quito y la segunda, también por Sebastián de Benalcázar, a inicios de 1535, a orillas del río Amay, actual río Babahoyo, se asentaría la ciudad de Santiago (de Guayaquil).
En agosto 1536, Hernando de Zaéra traslada Santiago a un sitio llamado Yahual, después de la destrucción de la ciudad asentada por Benalcázar. Ahí se mantuvo sin complicaciones y adoptando el nombre de Santiago de Culata.
Durante 1537, la ciudad se fue deshabitando por las incompatibilidades con los lugareños, para lo cual se encomienda a Francisco de Orellana, gobernador de Puerto Viejo, a pacificar la zona y buscar el nuevo asentamiento para la ciudad de Santiago. El sitio designado fue cerca de la desembocadura del río Yaguachi con el nombre de la ciudad Santiago de la Nueva Castilla.
En 1541, Orellana deja a cargo la villa a Diego de Urbina, su hombre de confianza, mientras ayuda a Pizarro en la guerra desatada con Almagro. Urbina tuvo que afrontar durante seis meses el asedio de los chonos, a la urbe; se traslada entonces a la población a vivir con los Huancavilcas, considerados gente de paz.
En 1543, fruto de la guerra entre Pizarristas y Almagristas, Urbina restaura la ciudad a la desembocadura del río Yaguachi; tiempo después y por la misma razón, el capitán Francisco de Olmos ajusticia a Manuel de Estancio, reemplazante de Urbina, y toma el mando de la ciudad, llamándola Santiago de Guayaquil y trasladándola a la confluencia de los ríos Daule y Amay, a las faldas del cerrito verde, llamado hoy cerro Santa Ana.
La ciudad de Santiago desde que fue trasladada por Benalcázar a la costa, ha sido reasentada en lugares que pertenecían a la región bañada por el río Babahoyo y Daule, llamada Huaillakil en idioma nativo. Efectuada la fundación de Santiago en Guayaquil pasa a tener una deformación Santiago de Guayaquil que también era llamada como Santiago en la región Quito o Santiago de Quito.
25 de julio de 1537 (como fecha oficial de celebración de la Fundación de Guayaquil)
En 1929, el Concejo Municipal de la ciudad, encargó a varios historiadores de la época, una investigación que permitiera definir la fecha en la que debía festejarse la fundación. La investigación estuvo a cargo de Modesto Chávez Franco, José Antonio Campos, Eleodoro Avilés, José Gabriel Pino Roca y Pedro José Huerta. La comisión determinó que, tras la consulta a fuentes y documentos, no se pudo determinar la fecha verdadera. Sin embargo, sugerían al Ayuntamiento de la ciudad Ayuntamiento Porteño que siguiera utilizando la fecha patronal de la ciudad; y, además, también sugerían que al no poder contar con un año preciso, se mantuviera el del asentamiento definitivo.
Desde la aprobación de esta disposición por parte del cabildo porteño, la fecha oficial adoptada es la del 25 de julio de 1537. Mientras que se considera como fundador definitivo a Francisco de Orellana.