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La alerta sanitaria extendida en Europa durante esta semana pone en valor la necesidad de detectar bacterias como E.coli con efectividad. Los métodos moleculares ofrecen mejoras en este campo: frente a las limitaciones que se han indicado de los métodos convencionales, las técnicas moleculares destacan por la posibilidad de diseñar un método en el que se pueda detectar de forma sensible y específica la bacteria objeto de estudio en un plazo corto (menos de 24 horas) con un coste ajustado. El empleo de métodos como la PCR a Tiempo Reales el que sirve de base para muchas técnicas de detección de patógenos, entre las que se encuentran la detección de Escherichia coli enterotoxigénico -en adelante STEC- incluyendo los E. coli enterohemorrágicos.
El método analítico consiste en primer lugar en la preparación de muestra en alimentos acorde a los protocoloshabitualmente establecidos en función del tipo de matriz objeto de análisis (según la serie de normas ISO 6887).
Posteriormente se somete la muestra a un enriquecimiento a 37ºC durante 18 horas, en el que pueden emplearse diversos caldos como:
• TBS modificado adicionado con acriflavina para products lacteos.
• Agua peptona tamponada para muestras que pueden contener capas estresadas como los alimentos congelados y con poca microflora acompañante.
• TBS modificado adicionado con novobiocina en el caso de muestras con altos niveles de flora acompañante.
Después del enriquecimiento se realiza una extracción de ácidos nucleícos y purificación de los mismos y, finalmente, la amplificación y detección simultanea de fragmentos genéticos propios de las STEC.
Los genes seleccionados en una primera fase de cribado son los genes stx1 y stx2 que codifican la toxina Shiga, siendo el gen stx2 el que se ha asociado más habitualmente con enfermedades graves en humanos, así como del gen eae que codifica la intimina relacionada con el mecanismo de adhesión de la bacteria.
En posteriores etapas y a partir de muestras positivas, se procede al aislamiento en medios de cultivo adecuados, como el medio CT-SMAC (Agar Cefiximida telurito sorbitol McConkey) incubado a 37ºC durante 24-48 horas, así como otros medios a elección del laboratorio.
La presencia de colonias típicas en estos medios de cultivo en las que se confirma la existencia de alguno de estos genes, permite concluir la presencia de STEC potencialmente patogénicos en la muestra analizada.
Todas estas etapas analíticas incorporan controles analíticos que permiten garantizar la fiabilidad de la técnica mediante el empleo de controles internos para detectar inhibiciones de la señal de PCR, de cepas de referencia con resultados positivos así como controles negativos para comprobar la ausencia de contaminaciones cruzadas en el laboratorio.
El método analítico consiste en primer lugar en la preparación de muestra en alimentos acorde a los protocoloshabitualmente establecidos en función del tipo de matriz objeto de análisis (según la serie de normas ISO 6887).
Posteriormente se somete la muestra a un enriquecimiento a 37ºC durante 18 horas, en el que pueden emplearse diversos caldos como:
• TBS modificado adicionado con acriflavina para products lacteos.
• Agua peptona tamponada para muestras que pueden contener capas estresadas como los alimentos congelados y con poca microflora acompañante.
• TBS modificado adicionado con novobiocina en el caso de muestras con altos niveles de flora acompañante.
Después del enriquecimiento se realiza una extracción de ácidos nucleícos y purificación de los mismos y, finalmente, la amplificación y detección simultanea de fragmentos genéticos propios de las STEC.
Los genes seleccionados en una primera fase de cribado son los genes stx1 y stx2 que codifican la toxina Shiga, siendo el gen stx2 el que se ha asociado más habitualmente con enfermedades graves en humanos, así como del gen eae que codifica la intimina relacionada con el mecanismo de adhesión de la bacteria.
En posteriores etapas y a partir de muestras positivas, se procede al aislamiento en medios de cultivo adecuados, como el medio CT-SMAC (Agar Cefiximida telurito sorbitol McConkey) incubado a 37ºC durante 24-48 horas, así como otros medios a elección del laboratorio.
La presencia de colonias típicas en estos medios de cultivo en las que se confirma la existencia de alguno de estos genes, permite concluir la presencia de STEC potencialmente patogénicos en la muestra analizada.
Todas estas etapas analíticas incorporan controles analíticos que permiten garantizar la fiabilidad de la técnica mediante el empleo de controles internos para detectar inhibiciones de la señal de PCR, de cepas de referencia con resultados positivos así como controles negativos para comprobar la ausencia de contaminaciones cruzadas en el laboratorio.
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