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Nació el 6 de agosto de 1881, cerca de Darvel, Ayr (hoy parte de Strathclyde), Escocia.
Hijo de Hugh Fleming (1816-1888) y Grace Stirling Mortonen (1848-1928). Hugh era padre de cuatro hijos sobrevivientes de su primer matrimonio y tenía 59 años en el momento de su segundo casamiento con Grace. Alexander fue el séptimo de ocho hermanos.
Su familia se dedicaba a la agricultura y la cría de animales. Con 13 años, tras la muerte de su padre, marcha a Londres junto con un hermanastro y su hermano John, ambos estudiantes de Medicina.
Antes de trasladarse a Londres asistió a las escuelas Louden Moor School, Darvel School y Kilmarnock Academy, en su ciudad natal. Trabajó cuatro años en una compañía marítima como administrativo antes de cursar estudios en el Instituto Politécnico de Regent Street, Facultad de Medicina del St. Mary's Hospital de la Universidad de Londres, donde se graduó con honores en 1905 como cirujano especializado, y donde trabajó como catedrático de bacteriología desde 1928 hasta 1948, año en que fue nombrado profesor emérito.
Participó en la Primera Guerra Mundial como capitán en el Cuerpo Médico del Ejército, aportando algunas innovaciones que quedaron ensombrecidas por sus otros descubrimientos posteriores. Realizó investigaciones durante la guerra procurando descubrir algo parecido al “salvarsan”, para controlar las infecciones. Desarrolló importantes investigaciones en los campos de la bacteriología, la quimioterapia y la inmunología. En 1922 descubre la lisozima, antiséptico presente en las lágrimas, las secreciones corporales, la albúmina y ciertas plantas.
El descubrimiento de la penicilina tuvo lugar accidentalmente en 1928 en el curso de sus investigaciones sobre la gripe. Fleming notó que sobre el plato estaba creciendo moho y que alrededor de este se había formado un halo o área libre de estafilococos, hecho que atrapó de inmediato su atención. Supuso, acertadamente, que esa capa de moho contenía alguna sustancia que inhibía el crecimiento de la bacteria. Llamó al principio activo penicilina notatum y en 1929 publicó su hallazgo en una revista especializada sin despertar mayor interés en la comunidad científica. Para 1932, Fleming había cambiado su objeto de estudio y jamás dio el paso crucial: probar la sustancia en ratones.
A pesar de haber descubierto una sustancia capaz de combatir las infecciones bacterianas, Fleming y sus colaboradores no lograron aislar la penicilina, el primer medicamento antibacteriano. El Prontosil lo desarrolló el químico Gerhard Domagk en 1935. La penicilina en estado puro la produjeron en 1940 Ernst Boris Chain y Howard Walter Florey. Realmente, la penicilina empezó a utilizarse masivamente en la II Guerra Mundial, y gracias a ella se salvaron muchas vidas.
Fue nombrado sir en 1944. En 1945 compartió el Premio Nobel de Fisiología y Medicina con los científicos británicos Howard Walter Florey y Ernst Boris Chain por sus contribuciones al desarrollo de la penicilina. En 1946 recibió la Medalla de Oro de Honor de la Royal College of Surgeons. En 1948 fue condecorado con la Gran Cruz de la orden de Alfonso X, el Sabio.
El 23 de diciembre de 1915, se casó con la enfermera irlandesa Sarah Marion McElroy. Su único hijo, Robert Fleming, (nacido en 1924) se convirtió en médico generalista. Tras la muerte de Sarah en 1949, Fleming se casó con la doctora griega Amalia Koutsouri-Vourekas, el 9 de abril 1953.
Años antes del infarto que el 11 de marzo de 1955 acabó con su vida en Londres, Alexander Fleming declaró que su único mérito fue no ignorar aquella sugerente capa de moho. Fue enterrado en la Catedral de Saint Paul, en Londres