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En 1852, Markham hizo planes para una prolongada visita a Perú. Apoyado por un regalo de su padre de 500 libras esterlinas (más de £ 40.000 en el 2008) para cubrir sus gastos, Markham zarpó de Liverpool el 20 de agosto.
Viajó por una ruta indirecta, procediendo primero a Halifax, Nueva Escocia, luego por tierra a Boston y Nueva York, antes de tomar un barco a Panamá. Después de cruzar el Istmo se embarcó al Callao, finalmente llegó el 16 de octubre. Partió para el interior del Perú, el 7 de diciembre de 1852, para cruzar los Andes hacia su meta, la antigua ciudad inca de Cuzco. En el camino, Markham se detuvo durante casi un mes en la ciudad de Ayacucho, para estudiar la cultura local y aumentar su conocimiento del quechua. Llegó al Cuzco el 20 de marzo 1853.
Markham se mantuvo en la ciudad durante varias semanas, investigando la historia inca y describiendo en su diario los muchos edificios y ruinas que visitó. Durante el transcurso de una excursión a las ciudades y ruinas cercanas él llegó a la zona de San Miguel, La Mar, Ayacucho, donde se enteró de las propiedades de la planta de cinchona, una fuente de la quinina, que se cultivaba en esa vecindad. Por fin salió del Cuzco el 18 de mayo, acompañado por un grupo de seis que, como él, estaban regresando a Lima. Durante su viaje pasó por las montañas a la ciudad de Arequipa, que más tarde sería descrita como "un ejemplo excepcional de un asentamiento colonial", con su mezcla de arquitectura nativa y europea. La ciudad está dominada por la forma cónica del volcán Misti, que Markham comparó con el Monte Fuji en Japón.
El 23 de junio, el grupo llegó a Lima, donde Markham se enteró de la muerte de su padre. Llegó a Inglaterra el 17 de septiembre.
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