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Durante el siglo XVI, varios religiosos, pensadores y políticos intentaron provocar un cambio profundo y generalizado en los usos y costumbres de la Iglesia cristiana en la Europa Occidental, especialmente con respecto a las pretensiones papales de dominio sobre toda la cristiandad. Más específicamente, rechazaron con determinación la validez de la venta de indulgencias propiciada por el Papa romano, a través de la cual la Iglesia de Roma "vendía" la salvación al mejor postor. A este movimiento religioso se le llamará posteriormente Reforma Protestante, por ser un intento de reformar la Iglesia buscando la revitalización del cristianismo primitivo y que fue apoyado políticamente por un importante grupo de príncipes y monarcas que "protestaron" contra una decisión de su emperador. Este movimiento hundía sus raíces en elementos de la tradición católica medieval, como el movimiento de la Devoción moderna en Alemania y los Países Bajos, que era una piedad laica antieclesiástica y centrada en Cristo. Además, la segunda generación del humanismo la siguió en gran medida. Comenzó con la predicación del sacerdote agustino Martín Lutero, que revisó las doctrinas medievales según el criterio de su conformidad a las Sagradas Escrituras. En particular, rechazó el complejo sistema sacramental de la Iglesia medieval, que permitía y justificaba exageraciones como la "venta de indulgencias", según Lutero, un verdadero secuestro del Evangelio, el cual debía ser predicado libremente, y no vendido.
La Reforma Protestante dependió del apoyo de algunas autoridades civiles para poder reformar iglesias de ámbito estatal (posteriormente iglesias nacionales). Los grandes exponentes de la reforma fueron Martín Lutero y Juan Calvino. El Protestantismo ha llegado a constituir la tercera gran rama del cristianismo, con una feligresía que actualmente supera los quinientos millones y que se expande rápidamente en América Latina, Asia y África.