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La causa inmediata de la guerra entre Francisco Pizarro y Diego de Almagro fue la posesión del Cuzco, la capital de los incas.
La Capitulación de Toledo, firmada el 26 de julio de 1529, sentó las bases jurisdiccionales de los territorios conquistados por Pizarro y Almagro, siendo ampliada después por la Real Cédula del 21 de mayo de 1534. En ella se establecía dos gobernaciones: para Pizarro la Gobernación de Nueva Castilla, que comenzaba en el norte en el pueblo de Teninpulla o Santiago (al norte del actual Ecuador) y se extendía 270 leguas hacia el sur. Y para Almagro, la Gobernación de Nueva Toledo, que se extendía inmediatamente al sur de la Nueva Castilla, extendiéndose en 200 leguas.
En teoría, no debía haber problemas en determinar exactamente donde terminaba la Nueva Castilla y donde comenzaba la Nueva Toledo, pero estalló entonces la controversia: mientras Almagro sostenía que las mediciones de las 270 leguas de la Nueva Castilla debía hacerse siguiendo las sinuosidades de las costas, con sus golfos y caletas, en cambio Pizarro sostenía que debía hacerse siguiendo la línea del meridiano. De acuerdo a la tesis de Almagro, la gobernación de Nueva Castilla terminaba al norte de Lima, y de acuerdo a la de Pizarro, terminaba al sur del Cuzco. Consultada la Corona española, esta daría la razón a Pizarro, pero su resolución llegaría muy tarde.
Convencido de su tesis, Almagro se dispuso a ocupar Cuzco en 1535, alentado por sus partidarios. La guerra civil habría estallado entonces, de no ser que el astuto Pizarro convenciera a su socio a que marchara a la conquista de Chile, situada al sur de su gobernación, pues decíase que era una tierra donde abundaban los metales preciosos y donde hallaría, presumiblemente, un segundo Cuzco. Almagro emprendió entonces la expedición a Chile, partiendo del Cuzco el 3 de julio de 1535. El viaje por Chile fue duro y penoso, no encontrando nada de valor, a pesar de haber llegado hasta la altura del actual Val paraíso. En su mayor parte era un territorio desértico, poblado de indios belicosos. Esta expedición duró alrededor de dos años, y terminó en 1537, con el retorno de Almagro y los restos de sus tropas, que descansaron en Arequipa, antes de marchar hacia el Cuzco.