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Los españoles ya habían explorado la zona en expediciones que tuvieron lugar entre 1513 y 1563,de la mano de Juan Ponce de León, pero sin llegar a levantar ninguna fortificación estable. Sin embargo, la presencia en 1564 de un nutrido contingente de hugonotes franceses, que alzaron un fuerte en la desembocadura del río San Juan, supuso una seria amenaza que llevó a España a la decisión de establecer una presencia militar permanente en el área.El 28 de agosto de 1565 Pedro Menéndez de Avilés funda la ciudad de San Agustín (Florida). Es el asentamiento europeo más antiguo ocupado hoy en EE. UU. Solo San Juan (Puerto Rico) la supera como ciudad más antigua de "los Estados Unidos".
En 1583 la Reina Isabel I de Inglaterra otorga una autorización al pirata Sir Walter Raleigh para fundar una colonia al Norte de Florida, a la que llamaría Virginia y que abarcaría Carolina del Sur, Carolina del Norte, Virginia, Virginia Occidental y Maine. Rápidamente se vio la posibilidad de explotar la zona con cultivos de tabaco, creándose en 1606 la Compañía de Virginia de Londres como sociedad anónima, que financió el primer establecimiento inglés.