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En 1502, navegando por las costas caribeñas desde el golfo de Honduras hasta Panamá, Cristóbal Colón tomó posesión de Centroamérica en nombre de la Corona española. Sus informes estimularon a los conquistadores españoles, pues hablaban de la existencia de riquezas y de grandes poblaciones detrás de las montañas del istmo. Diego, el hijo de Colón, había emprendido la conquista de la isla La Española (las actuales República Dominicana y Haití).
En 1510, Vasco Núñez de Balboa fundó en el Darién la primera colonia productiva de América, y fue el primer conquistador en remontar el istmo para llegar a la costa situada al otro lado, cuyas aguas bautizó con el nombre de mar Pacífico. Su sucesor, Pedrarias Dávila, que había ordenado la muerte de Balboa en 1517, extendió la colonización hacia el norte y hacia el sur; en 1519 fundó la ciudad de Panamá, desde donde emprendió la conquista de Nicaragua y Honduras. Tras ella, el territorio de Centroamérica se convirtió en escenario de la lucha entre españoles que poseían intereses en Panamá, La Española y México. Pedro de Alvarado, el lugarteniente de Hernán Cortés, el conquistador de México, consolidó el control de todo el istmo, especialmente después del triunfo sobre los mayas de Guatemala.
Los conquistadores asesinaron a una gran cantidad de indígenas, aunque las muertes entre éstos se debieron más a las epidemias de viruela, disentería y sífilis que llegaron con aquéllos. Los que sobrevivieron fueron esclavizados o reducidos a la servidumbre por los españoles, que implantaron una sociedad agrícola basada en instituciones traídas de la península Ibérica. No obstante, las costumbres y tradiciones indígenas se mantuvieron, gracias a que se establecieron muy pocos españoles en pueblos y ciudades.