Las acciones de Juana Azurduy que la fueron convirtiendo en una protagonista importante de las luchas por la independencia en el Alto Perú.
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En 1802 contrajo matrimonio con Manuel Ascencio Padilla, con quien tendría cinco hijos. Tras el estallido de la revolución independentista de Chuquisaca el 25 de mayo de 1809, Juana y su marido se unieron a los ejércitos populares, creados tras la destitución del virrey y al producirse el nombramiento de Juan Antonio Álvarez como gobernador del territorio. El caso de Juana no fue una excepción; muchas mujeres se incorporaban a la lucha en aquellos años.
Juana colaboró activamente con su marido para organizar el escuadrón que sería conocido como Los Leales, el cual debía unirse a las tropas enviadas desde Buenos Aires para liberar el Alto Perú. Durante el primer año de lucha, Juana se vio obligada a abandonar a sus hijos y entró en combate en numerosas ocasiones, ya que la reacción realista desde Perú no se hizo esperar. La Audiencia de Charcas quedó dividida en dos zonas, una controlada por la guerrilla y otra por los ejércitos leales al rey de España.
En 1810 se incorporó al ejército libertador de Manuel Belgrano, que quedó muy impresionado por el valor en combate de Juana; en reconocimiento a su labor, Belgrano llegó a entregarle su propia espada. Juana y su esposo participaron en la defensa de Tarabuco, La Laguna y Pomabamba.
Mención especial merece la intervención de Juana Azurduy en la región de Villar, en el verano de 1816. Su marido tuvo que partir hacia la zona del Chaco y dejó a cargo de su esposa esa región estratégica, conocida también en la época como Hacienda de Villar. Dicha zona fue objeto de los ataques realistas, pero Juana organizó la defensa del territorio y, en una audaz incursión, arrebató ella misma la bandera del regimiento al jefe de las fuerzas enemigas y dirigió la ocupación del Cerro de la Plata. Por esta acción y con los informes favorables de Belgrano, el gobierno de Buenos Aires, en agosto de 1816, decidió otorgar a Juana Azurduy el rango de teniente coronel de las milicias, las cuales eran la base del ejército independentista de la región.
Tras hacerse cargo el general José de San Martín de los ejércitos que pretendían liberar Perú, la estrategia de la guerra cambió. San Martín quería atacar Lima a través del Pacífico, por lo que era necesario, para poder desarrollar su estrategia, la liberación completa de Chile. Esta decisión dejó a la guerrilla del Alto Perú en condiciones muy precarias; Juana y su marido vivieron momentos extremadamente críticos, tanto que sus cuatro hijos mayores murieron de hambre. Justo lo habia estudiado una semana antes de salir de vacaciones