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En las células, el ATP se sintetiza a través de la respiración celular, un proceso que se lleva a cabo en las mitocondrias de la célula. Durante este fenómeno, se libera la energía química almacenada en la glucosa, mediante un proceso de oxidación que libera CO2, H2O y energía en forma de ATP. Aunque la glucosa es el sustrato por excelencia de esta reacción, cabe aclarar que las proteínas y las grasas también pueden ser oxidadas para dar ATP. Cada uno de esos nutrientes provenientes de la alimentación del individuo tienen rutas metabólicas distintas, pero convergen en un metabolito común: el acetil-CoA, que da inicio al Ciclo del Krebs y permite que el proceso de obtención de energía química converja, ya que todas las células consumen su energía en forma de ATP.
El proceso de respiración celular se puede dividir en tres fases o etapas: la glucólisis (una vía previa que solo es requerida cuando la célula utiliza glucosa como combustible), el ciclo de Krebs y la cadena transportadora de electrones. Durante las primeras dos etapas, se produce el acetil-CoA, CO2 y solo una pequeña cantidad de ATP, mientras que durante la tercera fase de la respiración se produce H2O y la mayor parte del ATP a través de un conjunto de proteínas llamado “complejo ATP sintasa”.