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La fundación de Guayaquil fue un proceso de conquista española en la actual región litoral de Ecuador, con lo cual, después de varios traslados y conflictos con pobladores nativos de culturas precolombinas, quedó definitivamente fundada la ciudad de Santiago de Guayaquil. La conquista se desarrolló entre 1534 y 1547, durante la cual fue cambiando de nombre de acuerdo al lugar de establecimiento, conservando el nombre de su santo patrono.
El proceso fundacional ocurrió tras el ingreso de Diego de Almagro a la serranía norte del antiguo Tahuantinsuyo de losincas, enviado por el marqués Francisco Pizarro desde el Cuzco, con el objetivo de acelerar la colonización de estos territorios y fortificarlos para contrarrestar la eventual invasión del adelantado Pedro de Alvarado, quien venía desde América Central. Almagro fundó la ciudad de Santiago de Quito el 15 de agosto de 1534, cerca de la actual localidad de Riobamba en Ecuador. Tras las negociaciones entre Almagro y Alvarado, la ciudad de Santiago tuvo que ser trasladada a otro sitio, ya que no cumplía con los requisitos impuestos por el rey de España en la Real Cédula expedida el 4 de mayo de aquel año, con lo cual se designó la salida de dos expediciones.
La primera expedición tomó rumbo norte y fundó la villa de San Francisco de Quito el 6 de diciembre de ese mismo año porSebastián de Benalcázar. A mediados de 1535, salió la otra expedición con destino hacia el litoral, sin embargo, tomaron rumbo sur de vuelta a Piura. Benalcázar agrupó a varios hombres y provisiones para zarpar vía marítima al golfo de Guayaquil y remontar el río Guayas para trasladar la ciudad de Santiago de esta región.