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Introducción
El estudio de los mecanismos cinéticos de enzimas y transportadores así como el efecto de sus inhibidores y activadores sigue siendo una herramienta útil para entender mejor la naturaleza y regulación de las vías metabólicas involucradas en los procesos bioquímicos de todas las células. El mejor entendimiento de los mecanismos catalíticos ha cobrado mayor relevancia biotecnológica ya que nos acerca a un mejor diseño de fármacos en el caso del tratamiento de enfermedades o para realizar modificaciones puntuales y obtener así una mayor producción de metabolitos. De esta forma, para obtener datos que permitan una mejor entendimiento de la participación de enzimas y transportadores en la fisiología de las células, se siguen diseñando compuestos cada vez más específicos que afecten la actividad (Vmax) o afinidad (Km) por sus substratos. Sin embargo, en muchos trabajos de la literatura donde se realizan estudios cinéticos, en ocasiones el análisis de los resultados es sobre-interpretado, incompleto o en el peor de los casos erróneo.
El objetivo de este trabajo es realizar una revisión de los métodos utilizados para analizar el tipo de inhibición de un compuesto. Estos métodos permiten comparar los datos experimentales con patrones predichos para diferentes mecanismos cinéticos, utilizando datos de velocidad inicial (es decir la velocidad de la reacción durante los primeros minutos o segundos, cuando la formación de producto es lineal con respecto al tiempo y la concentración de sustrato es mucho mayor que la concentración de enzima), experimentalmente el método para determinar los patrones de velocidad inicial consiste en variar la concentración de un sustrato frente a concentraciones fijas de otros sustratos y en ausencia de productos.
Existen dos estrategias para analizar el tipo de inhibición de un compuesto, el ajuste por regresión lineal y el ajuste por regresión no lineal.
Ajuste por regresión lineal
Este análisis es ampliamente utilizado en cinética enzimática, los datos se grafican de tal manera que en el eje x se representa la variable independiente y en el eje y la variable dependiente, la línea trazada por regresión lineal se elige para minimizar la suma de los cuadrados de las distancias de los puntos a partir de esa línea. Un método para tratar con relaciones curvas es transformar los datos en una línea recta y después realizar la regresión lineal. Algunos métodos de linearización utilizados son: Lineweaver-Burk (l/v versus l/S), Eadie-Hofstee (v versus v/S), Hanes (S/v versus S) y Scatchard (v/S versus v) donde v es velocidad inicial, S la concentración de sustrato. Estos métodos se pueden aplicar a la ecuación de Michaelis-Menten v=(Vmax [S])/ (Km+[S]), para determinar la Km y Vmax a partir de la pendiente y el intercepto. Entre ellos, el método de Lineweaver-Burk (dobles recíprocos) es el más utilizado como una herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima, cuyo reciproco es 1/v=Km/(Vmax [S])+1/ Vmax, donde v es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato. El gráfico de Lineweaver-Burk permite identificar la Km y Vmax; a partir del punto de intersección con el eje de las ordenadas es (l/Vmax), y el de las abscisas al origen se puede obtener (-1/Km). Realizar el ajuste por regresión lineal sobre datos transformados tiene algunas ventajas ya que es muy sencillo y no requiere un software específico, además resulta fácil de evaluar estadísticamente. Sin embargo, estos métodos son muy dependientes de la calidad de los datos de velocidad y se aplican sólo para mediciones de velocidad inicial (4). Los errores en la determinación de velocidad a bajas concentraciones de sustrato se amplifican en el método Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee y en menor media al utilizar Hanes, debido a que estas distorsiones se incrementan en transformaciones que combinan los valores de x y y.
Otra alternativa para determinar los mecanismos cinéticos es realizar ensayos de inhibición utilizando productos, altas concentraciones de sustratos alternos u otras moléculas análogas a cualquiera de estos. Se busca que los inhibidores utilizados sean reversibles, es decir deben formar complejos dinámicos (asociación-disociación) con propiedades catalíticas diferentes a las que tiene la enzima en ausencia del inhibidor. Los inhibidores reversibles pueden ser totales (lineales), es decir al saturar una enzima con un inhibidor total la actividad enzimática se abate por completo y al realizar los regráficos de la ordenada (1/Vmax versus [I]) y la pendiente (Km/Vmax versus [I]) del gráfico de dobles recíprocos se generan líneas rectas o inhibidores parciales (hiperbólicos) cuando se observa cierta actividad enzimática residual en presencia de una concentración saturante de inhibidor y en los regráficos de dobles recíprocos se obtiene una curva hiperbólica (2).
Explicación paso a paso: