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El trazado de la vía férrea cruzaría la Reserva de la Biosfera de Calakmul, en Campeche, como ya lo hace la carretera 186. En este punto será importante contener el crecimiento poblacional para evitar impactos negativos en la mayor reserva mexicana de bosque tropical.
Especialistas han declarado que el proyecto amenaza los ecosistemas y hábitats de las especies endémicas: jaguar, puma, tapir, pecari de labios blancos, saraguato de manto, mono araña, zopilote rey y águila elegante.
Sus efectos en las poblaciones de flora, en su mayoría caoba y cedro, pondrían en riesgo el equilibrio ecológico.
Además, proyectos de infraestructura como el Tren Maya pueden propiciar el surgimiento de asentamientos irregulares en áreas forestales conservadas.