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Cuando se desarrolló, era especialmente activa contra Gram positivos productores de β-lactamasas como Staphylococcus aureus, si bien el desarrollo de resistencia por parte de estos últimos (Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SAMR)) impide actualmente su uso clínico.
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La penicilina G presenta una buena actividad frente a la mayoría de los microorganismos Gram positivos aerobios y anaerobios. No es activa frente a microorganismos productores de betalactamasa como Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y la mayoría de las enterobacterias.
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