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Un examen microscópico es el primer paso a realizar para el estudio de muestras de tipo biológico. Es un examen que nos proporciona datos, como la presencia de microorganismos, su morfología, movilidad y características estructurales.
Debemos tomar en cuenta que a través del microscopio sólo se pueden observar objetos que dejen pasar los rayos de luz, por esta razón los preparados deben de ser lo más delgado y transparente posible, en el caso que se realice un preparado grueso sólo nos permite observar una mancha negra.
Para realizar preparaciones microscópicas, los portaobjetos y cubreobjetos deben limpiarse antes de usarse; un buen método es guardarlos en alcohol, y antes de utilizarles, secarlos con un paño limpio y libre de grasa.
Las técnicas de observación microscópica de microorganismos pueden dividirse en:
Examen en fresco.
Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de estudio y la presencia de otros elementos, como son leucocitos, células, eritrocitos, cristales, etcétera, que puedan ser de gran ayuda en la valoración de las muestras. Y se prepara de la siguiente manera:
Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a examinar se sitúa entre un portaobjetos y cubreobjetos. Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de emulsificar en una gota de agua destilada o solución salina; si el material es líquido, se deposita directamente entre el porta y cubreobjetos.
Exámenes en preparaciones coloreadas.
Las técnicas de coloración permiten la observación morfológica con un mejor contraste que en el examen en fresco, así como la observación de estructuras celulares. El examen microscópico de preparaciones teñidas tiene una serie de pasos comunes previos a la tinción, los cuales son:
Preparación del frotis:
La extensión de la muestra sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, dependiendo de la procedencia de la muestra a examinar. Si es líquida, se deposita una pequeña cantidad del material en el centro del portaobjetos y se extiende con otro portaobjetos hasta conseguir una capa fina y homogénea.
Si el material de estudio es sólido, se emulsificará en una gota de agua destilada o solución salina estéril, colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende de la misma forma que una muestra líquida.
Secado:
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos (sin quemar).
Fijado:
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir que la muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación rápida de las albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material celular, se recomienda fijar con alcohol metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el portaobjetos sobre una llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes de proceder a realizar cualquier procedimiento de tinción.
Tinción:
Consiste en cubrir la preparación con uno o varios colorantes de forma secuencial durante un tiempo determinado, si adiciona el colorante en un frotis sin enfriar, puede provocar la precipitación del colorante y la visualización de artefactos que pueden confundir en el proceso de observación al microscopio.