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La ciudad está ubicada en las coordenadas 3°27′00″N 76°32′00″O / 3.45, -76.533333, en el departamento del Valle del Cauca. Geográficamente Cali está en el valle del río Cauca, el segundo en importancia del país. A la altura de Cali este valle tiene 35 km de ancho y la zona urbana esta sobre el costado occidental del río. La parte occidental de la ciudad se encuentra custodiada por los célebres Farallones de Cali, que hacen parte de la Cordillera Occidental de los Andes colombianos.
Debido a la altura de los farallones y la cercanía del Océano Pacífico, que condiciona en gran parte el clima del occidente colombiano, se pueden encontrar diversos ecosistemas como la selva húmeda, bosque tropical, bosque de niebla y páramo. Éstos páramos son distintos a los otros Páramos de los Andes, debido a que esta zona ha estado geológicamente aislada de las demás.