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La institución más importante después de la figura del virrey fue la Real Audiencia. El virreinato del Perú tuvo dos audiencias: la de Lima (creada por las Leyes Nuevas de 1542 e instalada en 1544), cuya jurisdicción abarcaba toda las ciudades y provincias de América del Sur; y la del Cuzco, creada en 1787; subordinada a la de Lima. En términos generales, la función de este organismo fue una mezcla de poderes, pues no sólo gobernaba en lo político y en lo administrativo, sino que también era un tribunal superior en asuntos civiles y criminales. Sus funciones atañían la elaboración de leyes a favor de los indígenas, tribunal de primera instancia para juicios criminales, corte de apelaciones frente a las sentencias de corregidores y alcaldes inferiores, etc.
La Audiencia actuaba como asesor del virrey, por lo que muchas veces absolvió las consultas formuladas por el visosoberano. De igual manera, fue la encargada de tomar las riendas del virreinato cuando el virrey se encontraba enfermo o moría repentinamente.