Algunas características de los plásmidos que permiten utilizarlos como vectores es que presentan varios sitios de corte para las enzimas de restricción y que generan varias copias de un gen insertado. ¿Por qué crees que estas características son ventajosas para la clonación?
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Por qué un golpe de calor hace que las bacterias tomen el ADN? Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos
Respuesta:
Los vectores de clonación o vector molecular son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN a un vector, se utiliza una enzima de restricción que se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima, posteriormente, se adiciona la enzima Fosfatasa Alcalina, la cual es la encargada de evitar la recircularización del vector, ya que adiciona un extremo 3' Fosfato que evita la unión de ambos extremos así como la complementariedad y formación de un enlace fosfodiéster. Inmediatamente se adiciona el ADN que pretende insertarse en el vector, donde uno de los extremos se une por complementariedad y se utiliza una ligasa para generar la unión y su recircularización.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.
Todo vector de clonación debe contener los siguientes elementos:
Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA, el cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA cromosómico, ya sea en un sistema bacteriano o en un sistema de expresión en levaduras.
Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clonas que contienen el fragmento de DNA de interés. Ejemplos de esto son los genes que codifican para la resistencia a antibióticos, como lo son los de resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, o por el contrario, pueden ser marcadores metabólicos como el gen Lac Z, que codifica para la síntesis de la enzima beta galactosidasa o marcadores auxotróficos, como lo es el gen que codifica para la síntesis de histidina (muy utilizado en los sistemas de expresión y clonación en levaduras).
Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los genes que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de restricción, es decir, múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la inserción de los fragmentos de DNA que se desea clonar en un sistema.