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Atendiendo los reclamos de Gonzalo Jiménez de Quesada, Carlos V concedió a Santafé el título de ciudad el 27 de julio de 1540. Nueva Granada fue organizada bajo la autoridad de la Real Audiencia de Santafé.
La Real Audiencia fue creada por la Real Cédula del 17 de julio de 1549; la autoridad de ella comprendía los territorios comprendidos por las provincias de Santa Marta, San Juan, Popayán, Guayana y Cartagena de Indias. Aunque, las provincias de Caracas, Cumaná, y Maracaibo dependieron de la Real Audiencia, en diversas ocasiones, alternándose en esta función, sobre todo en el ámbito judicial, con la Real Audiencia de Santo Domingo, dependiente del Virreinato de la Nueva España.
La Real Audiencia, como tal era un organismo que administraba la justicia, sin embargo, se encargó la administración y pacificación del territorio. Su primera sesión se hizo el 7 de abril de 1550 en una casona que daba a la Plaza Mayor (hoy plaza de Bolívar), actual Palacio de Justicia. Los jueces de la Real Audiencia, eran conocidos como oidores.
Molesta con la gestión de los Oidores, la corona española enviaba a los Visitadores. Esto probó ser bastante ineficaz, por eso solo duró entre 1545 y 1558. La corona decide enviar a Santa Fe un hombre fuerte para controlar la situación. Por eso, desde 1564 hasta 1717 en la Nueva Granada existió un presidente, quien dirigía a la Real Audiencia a quien se le asignaron funciones de gobierno.
En 1715, los Oidores se rebelaron contra don Francisco Meneses Bravo de Saravia, originando una crisis en el sistema presidencial, el golpe contra Meneses y la nueva situación política en España de la época, acabaron con la presidencia y dio origen al virreinato.
Al ampliar la jurisdicción de la Capitanía General de Venezuela, la Real Cédula del 8 de septiembre de 1777 agregó a la jurisdicción de la Real Audiencia de Santo Domingo las provincias de Maracaibo y Guayana:
Así mismo he resuelto separar en lo jurídico de la Audiencia de Santafé, y agregar a la primitiva de Santo Domingo, las dos expresadas Provincias de Maracaibo y Guayana, como lo está la de Cumaná y las islas de Margarita y Trinidad, para que hallándose estos territorios bajo una misma Audiencia, un Capitán General y un Intendente inmediatos, sean mejor regidos, y gobernados con mayor utilidad de mi Real Servicio.
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