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La guerra que enfrentó a la Argentina, Brasil y Uruguay contra Paraguay, entre 1865 y 1870, respondió más a los intereses británicos y de acabar con un modelo autónomo de desarrollo como el paraguayo, que podía devenir en un «mal ejemplo» para el resto de América latina, que a los objetivos de unificación nacional y defensa del territorio proclamados por sus promotores. El Paraguay intervino en defensa del gobierno depuesto y le declaró la guerra al Brasil. Esto llevó a López a declarar la guerra también a la Argentina. Brasil, la Argentina y el nuevo gobierno uruguayo firmaron en mayo de 1865 el Tratado de la Triple Alianza, en el que se fijaban los objetivos de la guerra y las condiciones de rendición que se le impondrían al Paraguay.
La impopularidad de la Guerra de la Triple Alianza, sumada a los tradicionales conflictos generados por la hegemonía porteña, provocó levantamientos en Mendoza, San Juan, La Rioja y San Luis. La participación argentina en la guerra respondía también al interés del gobierno en imposibilitar una posible alianza entre las provincias litorales y el Paraguay. La guerra era para los paraguayos una causa nacional. Todo el pueblo participaba activamente de una guerra defensiva.
«En nuestro país, la oposición a la guerra se manifestaba de las maneras más diversas, entre ellas, la actitud de los trabajadores correntinos, que se negaron a construir embarcaciones para las tropas aliadas y en la prédica de pensadores que, como Juan Bautista Alberdi y José Hernández, el autor del Martín Fierro, apoyaban al Paraguay. En 1870, durante la presidencia de Sarmiento las tropas aliadas lograron tomar Asunción poniendo fin a la guerra. Pero lo cierto es que la guerra duró casi cinco años, le costó al país más de 500 millones de pesos y 50.000 muertos. Terminada la guerra, los ministros diplomáticos de los tres países se reunieron en Buenos Aires.
El regreso de las tropas trajo a Buenos Aires, en 1871, una terrible epidemia de fiebre amarilla contraída por los soldados en la guerra.