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Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos.
Físicos
Los fijadores físicos se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la estructuras que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o cuando el tipo de tejido y la técnica que usaremos lo requieran.
La congelación rápida es un buen método de preservación de las características moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Por ello es conveniente no usar piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la congelación de las zonas centrales de la pieza. Asimismo, cuando sea posible, es conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados crioprotectores. Una una congelación rápida se consigue sumergiendo la pieza en isopentano (-170 ºC) enfriado con nitrógeno líquido, o colocando la muestra sobre un metal, el cual se sumerge parcialmente en nitrógeno líquido (-196 ºC), en mezclas de hielo seco y acetona (-70 ºC) o incluso en helio líquido (-268 ºC). La crioprotección es siempre recomendable, aunque no siempre es posible. Normalmente se emplean como agentes crioprotectores al dimetilsulfóxido, el glicerol y la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado se vuelve a descongelar y hay que protegerlo de los procesos de degradación. Existen variantes a la técnica de congelación como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación parte de tejido previamente congelado al que posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido.
La fijación por calor no es frecuente en histología, puesto que produce deterioros de los tejidos. Su efecto es la coagulación de proteínas y disolución de lípidos. Sin embargo, se emplea para la observación de microorganismos, ya que preserva la forma de éstos y sirve para su identificación. Hoy en día, sin embargo, se suele emplear el calor como un complemento a la fijación química. Así, las muestras inmersas en un fijador se introducen en un microondas y se llevan hasta temperaturas de unos 55 ºC. Esta temperatura no produce artefactos y tiene dos ventajas: incrementa la velocidad de fijación y reduce el tiempo fijación desde varias horas o días a decenas de minutos. El uso del microondas permite que el calor sea homogéneo en toda la muestra de forma inmediata (si se hiciera en un baño caliente habría un gradiente de calor en la muestra desde la parte externa a la más interna.). Se cree que el incremento de la velocidad de fijación se debe sólo al calor generado y no al efecto directo de las microondas. Las microondas se pueden usar también para otros pasos del proceso histológico como la tinción.
Químicos
Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su degradación. Hay que considerar que los fijadores químicos afectan al tejidos tanto física como químicamente. Los efectos físicos suelen ser retracciones o distensiones, y la mayoría endurecen el tejido. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores líquidos: inmersión y perfusión.
Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de sangre o cortes por congelación sin fijación previa. En estos casos siempre se fijan por inmersión en la sustancia fijadora. Hay que tener en cuenta algunas precauciones.
1) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. La velocidad de penetración del fijador depende de cada fijador y de las características del tejido. Esta velocidad nos condicionará el tamaño de la muestra. Para fijadores lentos se recomiendan piezas de 0.2 cm de tamaño. Esto también se ve afectado por el tipo de tejido. Por ejemplo, si es poroso o con grandes espacios la difusión del fijador será más rápida.
Inmersión
Fijación por inmersión.
2) El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20 veces superior al volumen de la pieza.
3) La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.
4) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.
5) El tiempo de fijación, para una mismo tipo de muestra,