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Con la entrada de los españoles en la ciudad de Cuzco en 1541, concluyó la conquista llevada a cabo por Francisco Pizarro y dio comienzo el desarrollo del asentamiento colonial en el área dominada hasta ese momento por el Imperio inca (o Tahuantinsuyo) que, a partir de las nuevas leyes en 1542, entró a formar parte del Virreinato del Perú. Así durante el reinado del rey de España, Carlos V, por real cédula firmada en Barcelona el 20 de noviembre de 1542, se creaba el Virreinato del Perú, en reemplazo de la antigua Gobernación de Nueva Castilla, otorgada a Pizarro. Su demarcación incluyó con el tiempo el espacio comprendido entre los actuales Panamá y Chile, de norte a sur, a excepción de la actual Venezuela, y, hacia el este, hasta Argentina, con la excepción de Brasil, que pertenecía al Imperio portugués.
El primer virrey fue Blasco Núñez Vela, nombrado por real cédula del 1 de marzo de 1543. Sin embargo no pudo ejercer la autoridad real debido a los enfrentamientos entre los partidarios de Francisco Pizarro y Diego de Almagro por el dominio del Virreinato del Perú. Fue asesinado por Gonzalo Pizarro. El asesinato de la primera autoridad del rey produjo mucha consternación en España, entonces, la corona dispuso castigar severamente a quien había atentado contra el virrey, el representante del rey en territorios conquistados. Para ello, Carlos V envió a Pedro de la Gasca, con el título de pacificador para solucionar esta situación. Ya en el Virreinato del Perú, La Gasca ―seguro de haber infundido la semilla de la traición entre los partidarios de Gonzalo Pizarro― se enfrentó al conquistador, cerca del Cuzco, en 1548. Gonzalo Pizarro vio que sus capitanes se pasaron al bando de La Gasca y la derrota para él resultó aplastante. Conducido a la ciudad del Cuzco fue ejecutado por delito de alta traición al rey.Unos años después, en 1551, fue nombrado virrey Antonio de Mendoza, luego de haber ejercido el cargo en el virreinato de Nueva España. Tras casi 40 años de desorden administrativo, el virreinato peruano encontró a un eficiente conductor en Francisco de Toledo quien, entre 1569 y 1581, logró establecer el marco político-administrativo que regiría por muchos años en el Perú colonial.