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La contienda tuvo su base en la rivalidad entre las dos potencias que pugnaban por conseguir el liderazgo de la Confederación Germánica. En 1864, Austria y Prusia estuvieron aliadas en la guerra de los Ducados. De acuerdo con lo establecido en la Convención de Gastein que puso fin a ésta, el ducado de Holstein quedó bajo dominio de Austria, y los de Schleswig y Lauenburgo bajo el de Prusia, pero ninguno de los dos países quedó satisfecho con el acuerdo.
En octubre de 1865, el canciller prusiano Otto von Bismarck obtuvo de Napoleón III en Biarritz que Francia se mantuviera al margen de un previsible conflicto austro-prusiano, mientras que Prusia se comprometía a apoyar al Reino de Italia para conseguir la anexión del Véneto. Napoleón III pensó que el conflicto sería largo y le brindaría la oportunidad de actuar de mediador y tal vez conseguir ventajas territoriales, esperando en todo caso un fracaso militar de Prusia. El emperador francés se comprometió a mediar ante los italianos, lo que se logró con la alianza ofensivo-defensiva ítalo-prusiana contra Austria firmada en abril de 1866.
El canciller Bismarck entorpeció deliberadamente la gestión de la administración austriaca del Ducado de Holstein y envió tropas prusianas a ese ducado, después de asegurarse la neutralidad del Imperio ruso —todavía resentido por la neutralidad de Austria durante la guerra de Crimea— y contando con su alianza con el reino de Italia. Cuando Austria protestó ante la Dieta de Fráncfort (asamblea de la Confederación), Baviera, Hannover, Hesse-Kassel, Sajonia, Wurtemberg y otros Estados apoyaron a Austria.
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